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저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 식물줄기세포주 및 이의 분리방법

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기술개요

(1) 식물줄기세포 분리,배양에 관한 원천기술 보유

1) 식물줄기세포의 정의 및 개념

○ 식물줄기세포(plant stem cell)란 안정적인 형태로 자신의 identity를 유지하면서, 새로운 stem cell을 계속적으로 분열할 수 있는 능력을 가진 세포로서, 식물줄기세포의 가장 큰 특징은 무한정적인 self-renewal 과 다른 세포 종류로 분화할 수 있는 능력임

○ 이러한 식물줄기세포는 shoot(SAM) 과 root tip (RAM), vascular system (procambium/cambium)의 분열조직 (meristem)에 존재함. 지구상에서 100년 이상 생존하는 동물의 경우는 드물지만 식물체는 수백 년, 또는 수천 년까지도 생존할 수 있는데, 학자들은 이러한 식물의 놀라운 생명력의 근원(origin)이 식물의 줄기세포에서부터 왔다고 밝혀왔음

○ 즉, 식물 줄기세포는 놀라운 재생 능력을 가지고 있어, 수백 년의 기간 동안 식물이 성장할 수 있게 하고, 새로운 기관들을 생성할 수 있게 하기 때문에 오랜 세월 존재할 수 있는 것임

○ 이처럼 식물 생명력의 근원인 식물줄기세포가 식물의 분열조직에 존재한다는 것은 알려진 사실이었고, 지난 160여년의 식물조직배양의 역사 속에서 식물줄기세포를 순수하게 분리하려는 노력이 지속되었으나, 그 독특한 구조 때문에 식물줄기세포만을 순수하게 분리 및 배양에 성공하지 못하였음

○ 형성층(Cambium/Procambium)은 식물 전체에 위치하는 분열조직으로 얇은 세포벽을 갖는 소수층의 세포로 식물체에 극미량 존재하는 바, 이러한 구조적 특성 때문에 물리적인 힘이 가해지면 분리하는 과정에서 쉽게 손상되어 줄기세포의 특성을 잃게 되어 지금까지 분리 및 배양하는 것은 불가능한 것으로 여겨져 왔음

2) 세계최초로 식물줄기세포(CMCs) 분리∙배양 기술 확보

○ 운화는, 2005년에 세계최초로 식물줄기세포를 분리 및 배양하는데 성공하였고, 2006년부터 부설 운화과학기술원과 세계적인 줄기세포 및 생명공학 연구기관인 영국 에딘버러 대학교의 세포분자 식물생물학연구소와의 공동연구를 통해 식물줄기세포의 형태적∙유전적 특성을 규명했으며, 이 연구결과를 세계적인 과학저널인 Nature Biotechnology 2010년 11월에 발표했음(Lee, E.K., Jin Y.W., et al. Cultured cambial meristematic cells as a source of plant natural products. Nature Biotechnology 2010, 28,1213–1217; Roberts, S., Kolewe, M. Plant natural products from cultured multipotent cells. Nature Biotechnology 2010, 28, 1175-1176)

○ 상기의 연구를 통해 수혜기업이 형성층에서 분리한 세포가 진정한 식물줄기세포임이 입증되었고, 이러한 기술이 가지고 있는 무한한 산업적 가능성을 제시했음

○ 식물줄기세포의 분리 및 대량 배양할 수 있는 기술개발로, 식물을 이용한 유용물질 생산이 가능하게 되므로, 아직 초기 기술단계에 있는 식물줄기세포기술을 이용하면 항암제, 항HIV제 등 의약품, 식품, 화장품에 쓰이는 고부가 가치 핵심원료물질을 대량생산할 수 있고 식물 특성상 안전성도 높아 식물줄기세포의 산업적 이용가치가 높다고 예상되므로 이에 대한 연구 개발이 주목됨

3) CMCs의 산업화 가능성

① CMCs를 통한 유용물질 생산

○ 줄기세포는 식물세포 중 가장 생명력이 강하고, 생명현상이 활발하게 일어나는 세포로서, 유전자 발현 실험 결과, 줄기세포에 stress response 및 defense response 관련 유전자들이 높게 발현되고 있음을 발견하였음

○ 즉, 줄기세포에 외부 stress가 가해지면 줄기세포가 자기방어 기작으로써, 다양한 이차대사산물(secondary metabolites)을 생성시킬 수 있음을 확인하였기에, 이러한 화학적인 구성은 기존의 식물체가 가지는 chemical fingerprint와는 다소 차별화된 독특한 구성을 이루며, 배양조건에 따라 자연에서 희귀하게 존재하는 유용성분의 함량이 높아지기도 함

○ 더욱이, 줄기세포에 다양한 분화/배양 조건을 처리함으로써 target 하는 특정 물질(군)의 함량을 높일 수 있으므로, 이와 같이 줄기세포의 배양조건과 물질 함량 및 생리적 활성간의 상관관계를 분석하여, 최적의 배양/분화 조건을 발굴할 수 있음

○ 체세포의 경우, 분화 방향성이 이미 정해짐에 따라, 생성시킬 수 있는 물질의 종류 및 함량이 제한적이며, 탈분화된 캘러스의 경우, 탈분화 과정을 거치면서 유전적/후생유전적 변이가 발생함에 따라 이질적이고 불안정한 세포군을 이루게 되어, 장기 대량배양에 있어서의 안정성을 유지하기가 어려운 문제가 있는 것과 달리, 줄기세포 CMCs 배양의 경우, 특정 물질군의 함량, 효능 등의 최적화가 가능하며, 특정 분화/배양 조건이 확립되었을 경우, 이에 대한 재현 및 대량화가 용이함

② CMCs를 통한 생산의 생산성, 및 경제성

○ 15톤 탱크에서 한번 생산 시 얻을 수 있는 CMC의 dried cell 중량은 해당 시스템의 최적 생산 조건과 해당 식물 종의 cell line의 특성에 따라 달라질 수 있으며, 생산 시 cell 대 media 비율이 1: 1.5 ~ 3.5일 때, 15ton 배양 시 1 회 약 50 ~ 120 kg의 dried cell mass가 생산 가능하여, 고농도 배양연구를 통하여 동일한 효능 및 안전성을 지닐 수 있다고 가정했을 때 최대 1: 1.5 배양이 가능하며 이때 생산량은 15ton 탱크에서 약 120kg dried cell mass까지 생산 가능함

○ 생산 process상에서의 외부에서는 조절하기 힘든 빛, 온도 등의 다양한 환경 요소에 대한 control이 가능하므로 이에 따른 생산성 최적화 및 안정화를 꾀할 수 있음

○ 또한, 유전/생리적인 다양한 세포학적 특징을 유지하는 줄기세포의 고유 특성에 따라 장기적인 생산에도 변이의 우려가 적은 바, 노지의 인삼소재를 대량으로 얻기 위해서는 넓은 토지 및 수년간의 경작노력이 들어가며, 또한 얻어진 소재의 품질이 불균일한 경우가 많은 점을 감안할 때, CMCs에 의한 천연물 소재 생산은 제약 산업에서 요구하는 약효, 품질 및 대량화 측면의 요구를 모두 만족시키는 고부가가치 천연물 소재의 안정적 공급이 가능한 차별화된 생산방법임

○ 기능성 천연물 소재를 산업화하기 위해서는 품질의 일관성을 유지하기 위한 GAP(Good Agriculture Process) 등의 관리적 차원의 노력이 많이 필요한데, 산삼 CMCs의 경우 최종 산물의 품질관리 뿐 아니라, 배양 과정에서 세포 차원의 품질관리 및 조절이 가능하므로, GAP 보다 용이하고 차원 높은 품질관리가 가능함

○ 미국의 Phyton, Inc.사나 한국의 삼양제넥스 사가 식물세포배양을 통한 의약 API 생산의 산업화 모델을 실현하였으나, 탈분화된 배양 세포의 변이(variation), 대량화에 있어서의 기술적인 난점 등의 문제로 인해, 산업화를 위해 대량생산에서 그 생산성 및 경제성을 높이는데 한계가 있었음

○ 이에 반해, 수혜기업의 CMCs 배양 기술은 안정적인 배양특성을 가진 식물줄기세포를 바탕으로 이러한 한계를 극복함으로써 보다 효율적인 대량생산 시스템의 구축이 가능하게 되었음

○ 특히, 희귀하거나 멸종위기에 있는 식물을 이용한 글로벌 천연물 소재 개발에 있어서, CMCs 배양 기술은 산업화가 가능한 독보적인 방법이라 할 수 있고, 또한, 이렇게 생산된 dried cell line은 높은 품질, 동질성 및 유용물질 고함유로 인해 downstream 공정의 비용을 대폭 절감시킬 수 있을 것이며, 이로 인해 scale-up으로 인한 실질적인 비용절감 효과는 더 클 수 있을 것으로 기대함

③ 기존 배양 기술과의 비교 경쟁력 (캘러스배양과 식물줄기세포 비교)

○ 산삼 배양근은 산삼 주근에서 조직을 떼어내어 탈분화된 캘러스(dedifferentiated callus) 유도 후, 영양액에 배양하여 가는 부정근(不定根)을 재생시키는 조직배양 기술인데, 이 배양근을 생물반응기에 투입하여 계대배양하면 지속적으로 길이생장을 하며, 적절한 크기의 응집체(aggregation)로 배양시킬 수 있음

○ 이에 비하여, 식물줄기세포 배양은 캘러스(callus)가 아닌, 한 번도 분화된 적이 없는 미분화 세포를 분리하여 배양함으로써, 동질적인 세포를 변이 없이 단세포 배양(monocellular culture)할 수 있으며, 뿌리 배양에 국한된 부정근 배양과는 달리, 배양 시스템에 적절한 분화/배양 조건을 처리함으로써 다양한 화학적 fingerprint를 생성시킬 수 있음

○ 특히, 산삼 줄기세포는 강력하고 차별화된 stress 저항능력을 가진 식물줄기세포를 배양한 것으로 생물반응기 내에서 다양한 stress를 구현함으로써 줄기세포가 stress에 저항하는 과정 중에 생성되는 다양하고 차별화된 유용 성분을 생성시킬 수 있음
○ 또한, 산삼배양근은 탈분화 과정에 의해 유전적/후생유전적 변이가 발생할 수 있으나, 산삼CMCs는 미분화 상태의 세포를 분리/배양함으로써, 유전적/후생유전적 변이없이 원식물체와 동일한 특성을 가짐

④ Botanical drug으로의 개발 가능성

○ 식물줄기세포로 botanical drug을 개발할 경우, CMC(Chemistry, Manufacturing & Control)에 큰 장점을 가질 수 있고, 환경 친화적이며 GAP가 필요 없는 장점을 가지게 되는 바, 이러한 장점으로 인해 FDA의 Botanical Review Team으로부터 CMCs의 가능성을 높게 평가받은 바 있음

(2) 산삼 CMCs의 기능성 소재로의 우수성

1) 산삼 CMCs의 추출물의 항노화 활성 측정

① 피부섬유아 (HDF, Human diploid fibroblast) 세포 배양

○ HDF 세포는 태아의 음경포피로부터 분리 배양함. 세포 배양액은 DMEM (Invitroge Gibco life tech. Vienna, Austriea) 배지에 56℃에서 30분간 가열하여 비활성화시킨 우태아 혈청(FBS, Hyclone, Logan, Utah, USA)을 10%, 페니실린(penicillin) (100unit/㎖)과 스트레토마이신(streptomycin) (100㎍/㎖) 및 300 ㎍/㎖-glutamine을 첨가하여 조함. 세포는 위의 배양액을 사용하여 37℃, 95% 습도, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였고, 통상적으로 세포가 서로 융합되기 직전인 3~4일 간격으로 계대배양을 하였으며, 계대배양에 따라 20계대 이하의 어린 (Young) 세포, 21-49계대의 middle 세포와 50계대 이상의 노화세포로 구분함.

② UV에 의한 MMP-1 발현 억제 효능 확인

○ 자외선 노출에 의하여 MMP가 증가되는 경우, 증가된 MMPs는 피부의 콜라겐을 분해하여 피부주름을 형성시키는바, 자외선에 의해 증가된 MMP-1 발현이 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액에 의해 억제되는 효과를 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행
○ NHF(p6)를 12 웰 플레이트에 75,000 세포/well가 되도록 분주하고 24시간 starvation한 후 40 mJ의 UVB를 조사하고, 각 시료를 농도별로 48시간 처리하여 키트(Amersham, RPN 2610)를 이용하여 실험을 수행하였다. 양성 대조군으로는 10uM의 레티노인산(retinoic acid)을 사용
○ 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 세포주 배양액은 음성대조군 (Control UV)과 비교하여 유효하게 MMP-1의 발현을 억제하는 것으로 나타나 주름방지 및 개선효과가 있는 것으로 나타남. 특히, 원당 및 메틸 자스모네이트를 처리한 Elicitation 1과 메틸 자스모네이트만을 처리한 Elicitation 2의 세포주 배양액 모두 0.1%를 시료로서 처리한 경우 주름개선 효과가 강한 것으로 알려진 레티노인산에 비하여도 매우 우수한 효과를 가지는 것으로 나타남

③ 콜라겐분해효소 (MMP-1) 생성 억제효과 확인

○ 본 발명에 따른 산삼 형성층 유래 세포주의 노화방지 활성과 노지 산삼의 노화방지 활성을 비교하기 위하여, 경희대학교 피부생명공학센터에 의뢰하여 다음과 같이 상기 센터 표준업무지침서에 따라 실험을 수행함.
○ 먼저, 섬유아세포(MCTT사, 한국)를 2×104/(24 well)로 접종하고 12시간 배양하여 부착 후 FBS 무첨가 DMEM 배지에서 12시간 starvation함. DPBS 버퍼로 세척하고 365 nm 100 mJ/cm2를 조사함. 이때, 양성대조군으로서 RA(Retinoic acid)을 1μM 처리함. WST-1 용액을 이용하여 생존율을 측정하여 보정함.
○ 그 결과, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 경우 약 55% (1ppm), 약 67% (10ppm), 약 83%의 MMP-1 억제능을 보였으며, 세포주 배양액의 경우에도 약 49%(0.05 부피%), 약 63%(0.1 부피%), 약 70%(1 부피%)의 MMP-1 억제능을 보여 보였으며, 노화방지 효과가 우수한 것으로 알려진 양성대조군 RA와 대비하여서도 세포주 추출물 10ppm 및 50ppm 사용군 및 배양액 0.1 부피% 및 1 부피% 사용군에서 노화방지 효과가 더 우수한 것으로 확인됨.
○ 특히, 노지 산삼 뿌리의 동결건조 DMSO 추출물인 대조군과 대비하여서도, 세포주 추출물과 세포주 배양액 모두 훨씬 현저하게 MMP-1 발현을 저해하는 것으로 나타났는데, 상세하게는 노지 산삼 대비 세포주 추출물의 경우 27~51%의 억제능을 보였으며, 세포주 배양액의 경우 16~27%의 향상된 억제능을 보이는 것으로 확인됨.
○ 따라서, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 그 배양액은 노화방지 효과가 우수한 것으로 알려진 RA 및 산삼 추출물에 비하여 노화방지 효과가 매우 우수한 것으로 나타나, 노화방지용 조성물로서 특히 유용한 것으로 나타남

2) 산삼CMCs의 항산화 활성 효과

○ 자외선에 의한 증가된 활성 산소가 산삼CMCs 추출물 또는 그 배양액에 의해 억제되는 효과를 확인하기 위하여, 96well black plate에 HaCaT cell(German Cancer Research Institute, Heidelberg, Germany)을 30,000 세포/웰이 되게 분주하고 각 시료를 농도별로 3시간 동안 처리함. Control은 시료 및 UVB를 첨가하지 않은 것이고, UVB는 시료의 첨가 없이 UVB만 처리한 것을 나타냄.

○ 본 발명에 따른 세포주 추출물의 경우 배양액을 제거한 세포주를 이용한 경우(Wet)과 동결건조 세포주를 이용한 경우(Dry) 모두 Elicitation 1의 세포주 추출물에서 우수한 항산화 효과를 보임을 확인함. 그 다음으로는 Elicitation 2 단계와 Growth 단계가 비슷하게 나타남을 확인함. 또한 Elicitation 1 단계의 동결건조 세포주 추출물 (Dry) 50ppm 처리군에서 항산화 효능이 가장 우수하게 나타남이 확인함.

(3) 의약품 인허가에 있어서 산삼 CMCs가 갖는 장점

○ 미 FDA 관련 전문가들의 자문을 통하여, 후보물질이 검증된 안전성으로 인해 타 소재에 비해 상대적으로 신속히 임상 2상에 진입할 수 있음을 확인하였음

○ 이미 운화는 산삼 CMCs를 통해 한국에서 2006년 식품원료(식품 category: 조직배양삼)로 인가되어 지난 5년간 한국, 미국, 중국, 일본, 홍콩 등지에서 건강식품으로 판매되어 왔고, 아프리카 가나와 케냐에 Herbal medicine으로 등록되어 판매해 온 노하우가 있음.

○ 또한, 독성검사 및 임상실험을 통하여 안전성 검증이 검증되었음.

기술특징

1) 종래기술과는 차별되는 기술의 우수성

○ 식물세포배양의 세계적 권위자인 수잔 로버츠 박사는 2010년 Nature Biotechnology의 코너를 통해, 종래기술의 비교를 통한 운화 기술의 차별적 특징을 기고하였음.
“운화의 줄기세포(cambial meristematic cells: CMCs)를 통해 기존 식물세포 배양기술의 문제점들이 극복될 수 있음을 보여주었다. 산업적인 관점에서, 운화의 CMCs는 천연물질 생산에 있어, 기존 식물 세포배양 방법을 대체할 수 있다. 그러므로 CMC기술은 천연물 생산에서 경제적으로 실현 가능한 식물세포조직배양기술이다.”
Susan C.Roberts
University of Massachusetts의 세포공학 연구소 Director, 부교수

2) 첨단기술, 세계최초 개발기술

○ (주)운화는 영국 에든버러 대학교와 공동연구를 통해, 2010년 세계적인 과학저널인 Nature Biotechnology에 논문을 발표하였고, 이로써 ㈜운화가 형성층에서 분리한 세포가 진정한 식물줄기세포임이 입증되었음.
Lee, E.K., Jin Y.W., et al. Cultured cambial meristematic cells as a source of plant natural products. Nature Biotechnology 2010, 28,1213–1217; Roberts, S., Kolewe, M. Plant natural products from cultured multipotent cells. Nature Biotechnology 2010, 28, 1175-1176

○ ㈜운화의 식물줄기세포 분리․배양기술은 원료의 표준화, 품질관리 및 대량생산이 가능한 혁신적인 기술로써, 천연물 의약품 제조 공정의 새로운 표준이 될 수 있음.

3) 보유 기술의 권리화 현황
○ 현재 ㈜운화는 물질특허, 방법특허, 용도특허 등을 포함한 총 84개의 특허(해외특허 총 64개 포함)를 전략적으로 출원하고, 그 중 현재 총 55건의 등록특허(국내 15건, 해외 40건)를 보유하며 강력한 특허 포트폴리오를 구축함.

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