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쯔쯔가무시병 진단용 프라이머 및 이를 이용한 쯔쯔가무시병의 진단 방법

분야보건의료
거래유형기술이전 특허지원
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기술개요

본 기술은 쯔쯔가무시병 진단을 위해 conventional PCR을 이용하면서도 오리엔티아 쯔쯔가무시균(Orientia tsutsugamushi)의 16s ribosomal RNA 유전자를 증폭하여 오리엔티아 쯔쯔가무시균을 검출하는 방법을 제공함으로서,

① 기존의 46kDa, 57kDa, groEL유전자를 증폭하여 분석하는 방법에 비해 우수한 진단적 민감도와 정확도를 보이며,
② 본 기술에 의한 프라이머를 일반적인 PCR 방법인 conventional PCR방법을 수행하여도 비교적 진단적인 정확도가 우수한 nested PCR 또는 real time PCR 방법보다 진단적 정확도가 우수하므로,
③ 고가의 장비여서 쉽게 구비하지 못하는 등의 문제가 있는 real-time PCR 등의 진단적 정확도와 견줄 수 있어 비용-효과적인 측면에서 우월한 특징이 있으며,
④ 균주 특이적 16s rRNA 관련 primer를 이용하여 진단하는 방법으로 유사 바이러스 및 세균성 질환의 진단을 위한 방법과 병행하여 진단이 가능한 기술로서 다양한 질병을 one step 진단이 가능할 것으로 사료 됨

기술특징

■ 본 기술은 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 16s ribosomal RNA 유전자의 염기서열에 근거하여 오리엔티아 쯔쯔가무시를 검출하므로써 쯔쯔가무시병을 진단하는 방법에 관한 것으로 단 한번의 conventional PCR로도 기존의 nested PCR이나 real time PCR 방법보다 우수 진단법임
■ 또한 쯔쯔가무시병은 가을철 3대 발열질환(쯔쯔가무시병, 렙토스피라증 및 한탄바이러스에 의한 신증후출혈열 등)과 유사한 증상(고열과 피부병변)을 동반하기 때문에 질병초기에 각 질환을 감별하기가 쉽지 않아 이에 따른 개별 혹은 동시 진단이 필요한 질병이라 사료되며, 향후 3대 발열진단을 동시 진단할 수 있는 기술로의 개발을 고려하고 있음
■ 기술의 우수성: 민감도/정확도 측면에서 쯔쯔가무시병 환자로 확인된 115명과 비-스크럽 티푸스군로 확인되고 진단명이 분명한 52명의 혈액 검체를 이용하여 PCR 검사를 시행하였으며, 47kDa C-PCR 검사에서 115명 중에서 3명의 환자(3%)에서 양성을 보였으며, 47kDaN-PCR 검사 결과 115명 중 93명의 환자에서 양성을 확인할 수 있어 81%의 민감도를 확인할 수 있었다. 47kDa Q-PCR을 시행한 경우 38 cp 이상을 음성으로 채택할 때 115명의 쯔쯔가무시병 환자 중 87명의 환자에서 양성을 보여 76%의 양성율을 확인하였음
■ 56kDa protein gene을 target으로 한 C-PCR 검사에서 115명의 쯔쯔가무시병 환자군에서 9명의 환자에서 양성소견이 관찰되었고, N-PCR 검사상 115명 중에서 92명에서 양성을 보여 80%의 민감도를 보였으며, groEL gene을 target으로 시행한 C-PCR에서 115명의 쯔쯔가무시병 환자군에서 76명이 양성을 보였으며, 66%의 민감도를 보였음
■ 16s ribosomal RNA gene을 target으로 한 본 기술의 PCR 방법의 경우, 쯔쯔가무시병 환자군에서 100명에서 양성을 보여 86.7%의 민감도를 보였음,
■ 쯔쯔가무시병 진단에 있어서 현재 까지 개발된 여러 검사법의 민감도를 보면 항체를 이용한 검사의 민감도는 47% 를 보고하고 있으며,최근 각광을 받고 있는 민감도가 높다고 알려진 loop-mediated isothermal PCR assay 검사도 45%~56% 를 보고하고 있다. (PLoS Negl Trop Dis. 2011 Sep;5(9):e1307.)
실제 임상 환자의 검체를 이용하여 진단의 민감도를 시험해본 연구는 거의 없으며, 임상 검체를 이용한 PCR 임상적 유용성에 대한 논문 네 개를 확인할 수 있었다. 보고된 연구를 보면 180명의 발열 환자를 대상으로 시행한 연구를 보면 진단의 gold standard 법으로 알려진 IFA(immunofluorescence assay) 검사를 이용하였을 때, 급성기에 내원한 환자의 혈액을 이용한 IgM IFA 검사의 민감도는 14.3% 로 보고하고 있고, 가장 민감도가 높은 방법인 real time PCR을 시행하여도 민감도가 28.6% 를 보임을 보고하였다.(Am J Trop Med Hyg. 2013 Aug;89(2):308-10.)
태국 환자를 대상으로 한 임상 연구에서는 56-kDa gene 타깃으로 시행한 검사의 민감도가 29%, 16S rRNA 타깃으로한 PCR 이 44.8% 임을 보고하고 있다 (Am J Trop Med Hyg. 2006 Dec;75(6):1099-102.)
또 다른 인도환자를 대상으로 한 연구에서도 56-kDa gene 타깃으로 두 번 PCR을 시행한 nested PCR 검사도 민감도가 58% 임을 보고하였고 (Indian J Med Microbiol. 2011 Jan-Mar;29(1):47-50), 56-kDa gene 타깃으로한 real time PCR 도 73%의 환자에서 양성이 확인되었다. (Acta Tropica, Volume 104, Issue 1, October 2007, Pages 63–71).
이처럼 O. tsutsugamushi 는 세포내에서만 살 수 있는 절대 세포내 기생 세균으로 감염된 환자의 혈액 내에 그 양이 매우 적은량이 존재하여 conventional PCR을 시행하면 민감도가 매우 낮으며, 100배가량 민감도가 증가함이 알려진 nested PCR 이나 real time PCR을 시행하여도, 지금까지 보고된 모든 논문 및 특허를 통틀어도 그 민감도가 nested PCR이나 real time PCR을 시행해도 민감도 80%를 넘지 않았으나, 연구자가 개발한 검사법은 단 한번의 conventional PCR을 시행하여도 86.7% 의 민감도를 보이고 real time PCR을 시행할 경우 92% 까지 확인되어, 지금까지의 알려진 검사법중 가장 높은 민감도를 보이는 탁월한 진단법입니다.
쯔쯔가무시균에는 실로 다양한 유전자형이 존재하므로, 16 s ribosomal gene 을 target 으로 primers 를 design 하더라도, 사용한 primer 에 따라 민감도에서 차이를 확인 할 수 있다. Sonthayanon P. 등이 보고한 primer를 이용한 16s ribosomal RNA C-PCR 의 민감도가 44.8% 임에 반해 연구자등이 design 한 primers 를 이용한 c-PCR 의 경우 민감도가 86.7%로 이의 원인을 확인하기 위해 16 s ribosomal gene 을 target 으로 designed primers 를 비교 분석한 결과 우리가 design 한 PCR primers 는 대부분의 유전형을 모두 잡을 수 있으며, base variation 이 더 conserved 되어 있어 이 부위를 target 으로 하는 진단법은 진단법으로서 매우 유용함을 실제 115명의 쯔쯔가무시 환자의 임상 검체를 통해서 확인한 검사법입니다.

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회사명	한국보건산업진흥원	담당자	김대현
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