멤브레인 생물반응기를 이용한 고농도 유산균의 생산방법
1. 종래 개발기술 및 문제점 유산균의 배양은 일반적으로 회분식(Batch) 배양과 연속식(Continuous) 배양으로 나누어지는데, 기존의 산업에서는 회분식배양법이 많이 사용되어져 왔고, 최근 들어서는 연속식 배양에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있지만, 두 가지 모두 높은 균체농도를 얻는 데는 매우 제한적인데, 그 이유는 대사산물이 저해 요소(inhibitor)로 작용되어지기 때문이다. 유산균은 포도당 및 유당과 같은 당류를 대사시켜 젖산을 생성하고 다른 유기산 및 활성물질 등을 생성하여, 사람 및 동물의 장내에서 유해균을 사멸시키는 효과를 보이는데, 젖산, 유기산(예컨대, 초산 등), 유산균 대사경로에서 생성되는 과산화물, 펩타이드 등이 다량 생성되면, 배양액 내의 수소이온농도가 높아져 유산균의 대사 및 배양을 저해하는 현상을 보이게 된다. 또한, 기존의 회분식 배양 방법을 통한 유산균의 분말화 공정은, 생산물 내에 유기산 및 유산균의 대사산물이 제거되지 않은 채로 포함되어져 있는 상태로,건조보호제(Cryoprotectant)를 사용하여 동결건조의 과정을 거칠 경우 , 유산균의 공정 사멸율이 높아지며, 제조된 제품이 유통하는 단계에서 쉽게 사멸하는 등 많은 단점을 갖고 있다. 유기막인 중공사(Hollow fiber)막을 이용하는 특허의 개발도 시도가 되었으나, 침지방식으로서, 실제 생산에는 CIP의 어려움, 기타 가스의 사용 등의 이유로 사용되고 있지 않다. 특히 유기막은 산/염기에 약하고 수명이 1년 내외로, 내산/내염기에 견디면서 스팀 CIP가 가능한 수명 5년 이상의 무기(세라믹)막과는 실용성에서 많은 차이가 난다. 이러한 단점을 극복하고, 상업적으로 성공하기 위하여, 글로벌회사(Valio, Morinaga)나 유수한 연구소(파스퇴르 연구소 등)에서는 균주 개발을 통한 부가가치를 향상시키고 있다. 하지만, 한국의 경우는 유산균의 대량생산 공법과 더불어 공정개발 및 품질향상에 승부를 걸어야 한다. 실제로 글로벌 회사들도 상기와 같은 생산기술개발 및 최적 생산시스템을 확보하려는 움직임이 있다. 더불어 최근에는 유럽산 제품의 가격하락이 급속도로 이루어지고 있어 원가 경쟁력은 필수적이다. 2. 구체적 개발기술 설명 및 특징 상기 문제점의 극복을 위해, 생성물 분리용 멤브레인 및 배지 공급장치를 포함하는 멤브레인 생물반응기에서 유산균 균체를 배양하면서, 유산균의 성장을 저해하는 젖산, 유기산 등의 생성물을 연속적으로 제거하는 한편으로 배양배지를 연속적으로 공급하는 공정을 도입하여 유산균을 고농도로 생산하는 방법을 개발하고, 유산균의 대사산물이 제거된 상태의 유산균 균체를 동결건조 보호제 조성물을 사용하여 동결건조함으로써 현저하게 개선된 안정성을 보이는 유산균 분말을 개발하였다.
1. 구성 및 동작 본 발명은 유산균의 배양 공정에 있어서 저해물질로 작용하는 젖산, 유기산 등의 유산균 대사물질을 멤브레인을 통하여 제거하며, 동시에 균체량을 증가시키기 위하여, 연속적으로 배양배지를 공급하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 생성물분리용 멤브레인과 배지공급 장치를 포함하는 멤브레인 생물반응기에서 유산균 균체를 배양하면서, 배양배지를 배지공급장치를 통해 생물반응기로 공급하고, 생성물분리용 멤브레인을 통해 배양 여액은 연속적으로 분리 배출하고 유산균 균체는 연속적으로 생물반응기로 회수하는 단계를 포함하는, 멤브레인 생물반응기에서 유산균 균체를 고농도로 생산하는 방법을 제공한다. 추가적인 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 멤브레인 생물반응기를 통하여 얻어진 고농도의 균체를 동결건조보호제 조성물을 사용하여 동결 건조하는 단계를 포함하는, 유산균 분말을 생산하는 방법을 제공한다. 2. 기술의 효과 생성물분리용 멤브레인 및 배지공급장치를 포함하는 멤브레인 생물반응기에서 유산균 균체를 배양하면서, 배지공급장치를 통해 배양배지를 연속적으로 공급하고, 생성물분리용 멤브레인을 통해 유산균의 성장을 저해하는 젖산, 유기산 등의 유산균 대사물질을 연속적으로 제거하는 공정을 도입하여, 유산균 균체를 고농도로 생산할 수 있다. 본 발명에 의한 생산방법은, 기존의 회분식 배양방법에 비하여 배양기의 용량을 감소시키고, 배양 시간에 비해 높은 균체 수득률을 보이므로 설비 가동비 등의 운전비용의 절감시키는, 경제적인 배양방법이다. 또한, 본원 발명에 따라 수득한 고농도의 유산균 균체를 동결건조보호제 조성물을 사용하여 동결건조함으로써 물리적으로 및 화학적으로 높은 안정성을 갖는 유산균 분말을 생산할 수 있다. 1) MCR배양기술과 기존 STR배양기술의 비교 STR배양의 경우, 아래의 그림과 같이 균체의 증식에 따라 대사산물인 젖산의 농도가 5% 가까이 올라가면서, 유산균의 증식도 지수성장기를 지나 완만하게 성장하게 된다. 하지만, 본 MCR기술을 이용한 경우, 젖산의 농도가 2% 미만대로 낮아지면서, 유산균은 지속적으로 생육하여 OB생균수가 6.5E+10cfu/mL 이상으로 STR 배양시의 1.0E+10cfu/mL 보다 6배이상 높게 나타난다. 이를 동결건조를 통한 분말화 될 경우에는, g당 1.0E+12cfu 이상으로 기존의 STR배양보다 3~4배 높게 나타나게 되었다. 2) 유산균 제품內 젖산함량의 비교 본 기술을 이용하여 제조된 제품의 경우, 배지성분 및 대사 생성물의 효과적인 제거가 가능하여, 제품내 대사산물인 젖산의 함량이 기존의 제품에 비하여 월등히 낮다. 이러한 배지성분 및 젖산의 함량이 낮을 경우, 유산균의 제품화 이후 안정성 등이 개선되는 등, 순수한 유산균의 제조 및 박테리오신의 분리 정제에 효과적이다. 3) 유산균 제품內 젖산함량 별, 안정성의 비교 젖산의 농도를 인위적으로 조절하여 유산균제품의 분말화를 실시하고, 젖산 농도별 유산균의 안정성을 비교하였다. 제품의 안정성을 비교한 결과, 배양액내 젖산농도가 증가할 때 유의적으로 생존율, 제품생균수, 안정성이 하락함을 알 수 있었다. 아래의 그림과 같이, 배양액내 젖산함량이 낮은 본 기술을 이용한 유산균 제품의 경우, 유산균 제품의 안정성저하, 수율저하, 생균수저하등의 문제를 해결할 수 있음을 알 수 있다. 4) 가혹안정성의 비교 유산균제품의 유통기한내의 안정성을 유추하기 위해서, 일반적으로 가혹안정성 실험법을 사용하게 된다. 40℃ 4주실험의 결과를, 상온 1년으로 갈음하여 판정한다. 본 MCR배양기술을 이용한 유산균과 STR 배양법으로 제조한 유산균 원말의 안정성을 비교하였다.유산균의 속(Genus)별로 안정성은 일반적으로 상이하게 나타나나, 전체적으로 MCR 배양기술을 이용한 유산균 원말의 안정성이 약 40~60% 우수하게 나타났다.
관심기술등록 목록
