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패혈증 비브리오균의 플라젤린과 병원체의 항원 단백질을 융합시켜 제조한 재조합 융합 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 점막 투여용 백신

분야보건의료
거래유형국내기술이전 해외기술이전
업체-

기술개요

․ 본 기술에서는 패혈증 비브리오균 플라젤린 FlaB와 폐렴구균의 표면 단백질 PspA로 구성된 백신보조제-항원 융합 재조합 단백질(PspA-FlaB 또는 FlaB-PspA)을 제작 및 분리하여 마우스의 비강내로 면역한 후 폐렴구균의 감염에 대한 방어면역능을 타진한 결과, PspA 단독으로 면역한 군에 비해 PspA-FlaB 또는 FlaB-PspA로 면역한 군에서 혈청 및 점막분비물에서 PspA 특이적 항체(IgG 및 IgA)의 생성이 유의하게 증가하였고 치사량의 폐렴구균을 주사한 경우 월등한 방어면역능을 나타내는 것을 확인하고 이를 완성하게 되었다. ․재조합 플라젤린, PspA 및 융합 단백질의 제조 및 분리 : 항원으로서 S. pneumoniae의 PspA 유전자의 알파 나선 도메인(α-helix domain) 부분의 N-말단 또는 C-말단 융합용 DNA 조각을 하고, 백신보조제로서 패혈증 비브리오균 플라젤린 유전자 flaB 또한 PCR을 이용하여 증폭하여 각각을 pCR 2.1-TOPO 클로닝 벡터(Invitrogen)에 클로닝 함. : FlaB-PspA 및 PspA-FlaB 융합 단백질 제작을 위하여 상기의 pCR 2.1-TOPO::flaB 또는 pCR2.1-TOPO::PspA로부터 각각을 제한효소로 자른 후 IMPACT system(New England Biolab)의 단백질 발현 벸터 pTYB12 플라스미드에 flaB-PspA 또는 PspA-flaB 순서로 클로닝 함. : 이들 플라스미드를 ER2566 대장균에 transformation 후 5-브로모-인돌-3-클로로-이소프로필-β-D-갈락토피라노시드(IPTG)로 발현을 유도하여 제조사의 지침에 따라 분리하고 내독소(endotoxin)을 제거함. ․플라젤린-PspA 재조합 융합 단백질의 TLR-5 자극 활성 : 24-웰 평판 배양기에 293-T 세포를 1× 105 세포씩 분주하여 하룻저녁 배양한 후 Effectene(QIAGEN)을 이용하여 NF-κB-Luc 플라스미드와 TLR-5 유전자가 클로닝된 p3xFlag-hTLR-5 플라스미드 및 β-갈락토시다아제(β-galactosidase) 발현 대조군 플라스미드(Clontech)를 동시에 세포내로 도입시킴. : 24시간 추가배양 후 새로운 배지로 교체하고 FlaB, PspA-FlaB 및 FlaB-PspA 단백질을 일정 시간 처리한 후 루시퍼라아제(luciferase) 활성을 발광분석기(Luminometer, Berthold사)를 이용해 측정하여 NF-κB 전사 정도를 확인함. : 그 결과 PspA-FlaB 및 FlaB-PspA 재조합 융합 단백질 모두 FlaB 단독으로 처리했을 때 보다 각각 1.3배 및 3배 높게 NF-κB 전사를 활성화시키는 것으로 보아 PspA-FlaB 또는 FlaB-PspA 재조합 융합 단백질 중의 FlaB가 TLR-5 매개에 의한 NF-κB 전사 활성능을 보유하고 있음은 물론이고 훨씬 그 능력이 향상되었음을 알 수 있었음. ․ 플라젤린-PspA 재조합 융합 단백질의 방어 면역능(protective immunity) 검사 : SPF(specific pathogen free) 5주령 Balb/c 암컷 마우스의 비강내로 PBS(phosphate buffered saline), 2.5 ㎍ PspA, 2.5 ㎍ PspA와 4 ㎍ FlaB의 혼합물, 6.5 ㎍ PspA-FlaB 및 FlaB-PspA를 2주일 간격으로 3회에 걸쳐 각각 면역시키고 마지막으로 면역한 날로부터 14일 후에 마우스의 혈청, 침(saliva) 및 질세척액(vaginal wash)을 채취한 다음 PspA-특이적 전신 면역 반응(systemic immune response)과 점막 면역 반응(mucosal immune response)을 ELISA(Enzyme linked immuno sorbant assay) 방법으로 측정하였고, 3회에 거쳐 예방접종한 마우스에 반수 치사량(lethal dose 50%, LD50)의 200배에 해당하는 야생형 Streptococcus pneumoniae D39를 비강내로 투여하여 14일 동안 마우스의 생존을 관찰하였음. : PBS만을 투여한 대조군(PBS)이나 PspA 단독(P) 또는 PspA와 FlaB 혼합물(P+F)을 투여한 마우스에서 보다 PspA-FlaB(PF) 및 FlaB-PspA(FP) 재조합 융합 단백질을 투여한 마우스에서 PspA 항원 특이적 전신 면역 및 점액성 면역 반응이 높게 나타남. : 또한 PBS 만으로 면역한 대조군 마우스(PBS)는 3일 내에 100%가 사망하였고 PspA만을 투여한 마우스(PspA)에서는 약 20% 마우스만이 생존하였고 PspA와 FlaB의 혼합물을 투여한 경우(P+F) 약 20% 생존율을 보였으나 PspA-FlaB(PF) 및 FlaB-PspA(FP) 재조합 융합 단백질을 비강으로 투여한 경우 40% 및 60% 생존하였음.

기술특징

․본 기술은 백신보조제로서 패혈증 비브리오균의 플라젤린 단백질과 병원체의 단백질 항원을 융합하여 제조한 재조합 융합 단백질에 관한 것으로 사용하는 병원체의 단백질 항원으로는 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)의 표면 단백 A(PspA)의 알파 나선 도메인(α-helix domain) 및 폐렴구균 표면 부착인자 A(PsaA: pneumococcal surface protein A), 인플루엔자 바이러스의 서브유닛 HA(hemagglutinin) 및 NA(neuraminidase), 중증급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS 바이러스)의 스파이크(S) 단백질 등 감염질환에 대한 중요한 항원 단백질을 다양하게 적용할 수 있는 장점이 있다. ․또한 본 기술에서 사용하는 패혈증 비브리오균 플라젤린과 폐렴구균 항원 PspA를 융합한 재조합 단백질은 그 자체로 백신제제로 사용할 수도 있고, 현재 널리 사용되고 있는 폐렴구균의 다당질-단백 결합 백신의 효능을 높일 수 있는 새로운 컨쥬게이션 파트너로 사용될 수도 있다. ․본 기술에 의한 재조합 융합 단백질은 패혈증 비브리오균의 플라젤린과 병원체 항원 단백질을 유전자 수준에서 융합시키고 발현 및 분리 정제하여 제조할 수 있다. ․즉 본 기술은 상기 재조합 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 점막 투여용 백신에 관한 것으로 비점막(Nasal mucosa) 투여용 백신을 제공할 수 있으며, 폐구균, 인플루엔자 바이러스 또는 중증급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS 바이러스)에 대한 백신으로 제형화될 수 있다. ․ 또한 본 기술구성을 토대로 하여 상기 백신보조제인 플라젤린과 감염질환, 항암 및 여러 가지 질병에 대한 항원을 융합하여 다양한 재조합 융합 단백질을 제조하고 이를 유효성분으로 포함하는 백신을 제공할 수 있을 것이다.

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